細(xì)胞凍存后復(fù)蘇的存活率，直接影響后續(xù)實(shí)驗的質(zhì)量和可靠性。提高細(xì)胞凍存后的復(fù)蘇存活率可以從我凍存、復(fù)蘇以及后處理三個方面進(jìn)行優(yōu)化。

 一、凍存階段

1.選擇合適的凍存液：

最常見：90% FBS + 10% DMSO

有些細(xì)胞（如干細(xì)胞）推薦使用商業(yè)化凍存液（如StemCell BankIt、Gibco Recovery™）

2.細(xì)胞狀態(tài)要好：

凍存前最好處于對數(shù)生長期，活力高

死細(xì)胞或過度融合的細(xì)胞難以復(fù)蘇

3.細(xì)胞濃度合適：

推薦密度：1×10⁶～5×10⁶ cells/mL，太稀不易成活，太密會營養(yǎng)競爭

4.降溫速度要慢（-1°C/min）：

使用程序降溫盒（如Nalgene Mr. Frosty）+ -80°C冷凍一晚

然后轉(zhuǎn)入液氮罐（長期保存）

 二、復(fù)蘇階段

1.快速解凍：

將凍存管迅速置于 37°C水浴中搖晃，約1分鐘解凍完畢

減少細(xì)胞處于0～15°C之間的時間，防止形成冰晶

2.立即稀釋 DMSO：

解凍后馬上轉(zhuǎn)入預(yù)熱的培養(yǎng)基中緩慢滴加（防止?jié)B透壓沖擊）

可用 10mL完全培養(yǎng)基稀釋，1000 rpm 離心3-5 min 去除 DMSO

3.培養(yǎng)基要“溫暖而新鮮”：

用新配好的完全培養(yǎng)基，含10% FBS

可添加少量抗生素以防止污染（但不建議長期用）

 三、后處理和養(yǎng)護(hù)

1.不要急于換液：

復(fù)蘇24小時內(nèi)盡量不換液，給細(xì)胞“喘息時間”

2.密度不能太低：

密度過低影響貼壁/生長，復(fù)蘇后可適當(dāng)密植

3.加入細(xì)胞保護(hù)劑（可選）：

如：ROCK 抑制劑 Y-27632（用于hESC/iPSC），可明顯提高復(fù)蘇效率

 補(bǔ)充注意事項：

貼壁細(xì)胞復(fù)蘇后可能貼得慢，不要急于判斷死亡

有些敏感細(xì)胞系凍存時可適當(dāng)加 葡萄糖/丙酮酸鈉/甘油三酯等作為輔助保護(hù)

如果復(fù)蘇率依舊低，可嘗試：

凍存時加 抗氧化劑（如NAC）

使用 專用凍存試劑盒